Silk-Fibroin sebagai Matriks Imobilisasi Enzim yang Biokompatibel dan Dapat Diserap Secara Hayati untuk Biosensor Glukosa Amperometrik yang Dicetak di Layar

Abstrak
Sutra-fibroin digunakan sebagai matriks imobilisasi enzim yang biokompatibel dan dapat diserap secara biologis dan ditunjukkan sebagai contoh untuk biosensor glukosa amperometrik sablon. Sutra-fibroin berasal dari ulat sutra Bombyx mori . Matriks imobilisasi enzim yang terdiri dari sutra-fibroin, bersama dengan glukosa oksidase dari Aspergillus niger , diaplikasikan pada elektroda kerja berbasis karbon sablon, biokompatibel, dan dapat terurai secara hayati pada substrat sutra-fibroin yang fleksibel. Biosensor dikarakterisasi secara elektrokimia pada konsentrasi glukosa fisiologis dalam kisaran 0,5 hingga 10 mm . Hasilnya dibandingkan dengan biosensor glukosa “konvensional”, yang juga dibuat pada substrat sutra-fibroin yang fleksibel, namun menggunakan matriks imobilisasi enzim standar laboratorium berdasarkan albumin serum sapi dan glutaraldehida. Selanjutnya, pengaruh pH (pH 5,5 hingga pH 8,0) dan variasi suhu (21 hingga 70 °C) pada dua matriks imobilisasi yang berbeda ini dipelajari.

1 Pendahuluan
Sensor di bidang rekayasa biomedis kini dapat digunakan untuk berbagai parameter penting, termasuk suhu, pH, konsentrasi ion (misalnya, natrium, kalium, amonium), dan produk metabolik seperti glukosa, urea, dopamin, atau adrenalin. [ 1 – 8 ] Akan tetapi, untuk memungkinkan penggunaan langsung pada pasien sebagai sensor implan, bahan yang diaplikasikan (sensor) harus biokompatibel, ramah kulit, dan noninflamasi. Oleh karena itu, banyak bahan sintetis (polikaprolakton (PCL), poli(3,4-etilendioksitiofena)-polistirena sulfonat (PEDOT:PSS), polietilen glikol (PEG), polilaktida (PLA), poli(vinil alkohol) (PVA)) dan bahan alami (kitosan, kolagen, asam hialuronat, alginat, dan gelatin) telah dipelajari secara ekstensif dalam literatur untuk penggunaannya dalam aplikasi penginderaan, seperti untuk perangkat yang dapat dikenakan atau implan. [ 9 – 19 ]

Dalam kasus sensor (bio) yang dapat ditanamkan, bahan yang dipilih harus biokompatibel dan idealnya dapat diserap secara biologis. Dengan cara ini, sensor (bio) dapat tetap berada di dalam tubuh manusia dan terdegradasi sendiri setelah jangka waktu tertentu, menghindari pembedahan sekunder dengan risiko dan biaya terkait dari prosedur ini. Fibroin sutra, protein yang diekstraksi dari serat sutra dari kepompong sutra yang dihasilkan oleh ulat sutra Bombyx mori , merupakan bahan yang cocok untuk tujuan ini. [ 20 ] Fibroin sutra menggabungkan biokompatibilitas dan bioresorbabilitas yang dapat disesuaikan waktu dalam kondisi fisiologis bersama dengan sifat mekanis yang luar biasa, seperti fleksibilitas dan kekuatan tarik yang tinggi, perpanjangan putus yang tinggi, serta berbagai morfologi yang dapat diakses. [ 21 – 24 ] Bergantung pada kondisi fabrikasi, fibroin sutra dapat dibentuk, misalnya, menjadi perancah, spons, hidrogel, membran, serat, dan bubuk, dan dapat digunakan untuk perekat atau sensor. [ 13 , 25 – 32 ] Contoh aplikasi sensor yang dibahas dalam literatur mencakup sensor gas, kelembaban, suhu, dan tekanan, serta memristor, penginderaan hamburan Raman yang ditingkatkan permukaannya, dan transistor efek medan gerbang yang diperluas. [ 33 – 40 ] Selain itu, pendekatan penelitian saat ini dikhususkan untuk penggunaan fibroin sutra sebagai matriks imobilisasi untuk biosensor glukosa kolorimetrik, sebagai agen penutup ujung permukaan untuk nanopartikel untuk mendeteksi residu antibiotik, atau untuk titik kuantum oksida grafen tereduksi yang dihiasi fibroin sutra untuk mendeteksi levodopa. [ 41 – 43 ]

Baru-baru ini, kelompok kerja kami mengeksplorasi sutra-fibroin sebagai bahan substrat (membran fleksibel) untuk biosensor glukosa yang dicetak di layar, fleksibel, dan biokompatibel. [ 13 , 44 , 45 ] Di sini, pasta karbon yang biokompatibel dan dapat diserap secara biologis dicetak di layar ke substrat sutra-fibroin; untuk fungsionalitas sensor, glukosa oksidase (GOx) diimobilisasi dalam matriks imobilisasi yang mengandung bovine serum albumin (BSA) dan glutaraldehida. [ 13 ] Di sini, glutaraldehida, yang sering digunakan sebagai sterilan dingin, dapat menyebabkan iritasi atau sensitisasi pada kulit dan organ. [ 46 ] Selain itu, ia bersifat sitotoksik dan oleh karena itu hanya sebagian berlaku untuk biosensor yang biokompatibel, dapat ditanamkan, dan dapat diserap secara biologis. [ 46 , 47 ] Di sisi lain, sutra-fibroin dapat berfungsi sebagai matriks imobilisasi untuk memfiksasi enzim. [ 48 , 49 ] Dilaporkan bahwa untuk GOx, sutra-fibroin dapat meningkatkan kemampuan penyimpanan enzim dan meningkatkan ketahanannya terhadap fluktuasi pH dan suhu. [ 50 ] Selain itu, biopolimer mengubah nilai pH optimal aktivitas GOx dari pH 5,5 ke nilai yang lebih tinggi dan lebih basa sekitar pH 7,5. [ 50 – 52 ] Sementara pengaruh sutra-fibroin pada GOx ini dibahas dalam literatur, masih kurang eksperimen yang mempelajari aplikasi sutra-fibroin sebagai matriks imobilisasi untuk GOx dalam biosensor amperometrik.

Oleh karena itu, kami menguji strategi imobilisasi baru yang memanfaatkan serat sutra-fibroin sebagai matriks imobilisasi untuk biosensor glukosa amperometrik berbasis karbon yang dicetak sablon, menggunakan GOx sebagai enzim model. Strategi ini memperhitungkan persiapan matriks imobilisasi serat sutra-fibroin; biasanya, serat sutra-fibroin yang dikeringkan dengan udara pada kondisi ruang laboratorium dapat larut dalam air; dengan meningkatkan rasio kristalinitas biopolimer serat sutra-fibroin semi-kristalin, membran yang tidak larut dalam air dapat dirancang. Metode yang umum digunakan untuk peningkatan kristalinitas membran serat sutra adalah pemanasan dengan air atau etanol, perlakuan tekanan dan suhu, atau peregangan. [ 51 ] Atau, etanol atau gliserol dapat ditambahkan langsung ke larutan serat sutra cair. [ 13 ] Di sini, kami secara sistematis mempelajari proses penyiapan matriks imobilisasi sutra-fibroin yang tidak larut dalam air dengan menambahkan etanol atau gliserol ke dalam larutan imobilisasi sutra-fibroin, atau dengan merendam matriks imobilisasi kering ke dalam larutan etanol 80 vol%. Selanjutnya, optimasi kandungan sutra-fibroin dan pemuatan GOx dalam matriks imobilisasi sutra-fibroin dilakukan. Kinerja biosensor amperometrik dianalisis berkenaan dengan variasi suhu dan pH. Untuk mengklasifikasikan hasil yang diperoleh ke dalam state-of-the-art, studi komparatif dilakukan di mana protokol imobilisasi konvensional (BSA/glutaraldehid/GOx) dengan struktur lapisan analog dari elektroda kerja digunakan.

2 Bagian Eksperimen
2.1 Bahan
Bovine serum albumin (96%), etanol (99%), gliserol (99,5%) glukosa monohidrat (99%), glukosa oksidase dari Aspergillus niger (EC 1.1.3.4.), disodium hydrogen phosphate dihydrate (tingkat analitis), sodium dihydrogen phosphate monohydrate (tingkat analitis) dan karbon nanotube berdinding banyak (Art. No. 901019) dibeli dari Sigma–Aldrich (St. Louis, AS). Ecoflex 00–30 diperoleh dari KauPo Plankenhorn eK (Spaichingen, Jerman). Kedua komponen Ecoflex didegaskan dalam vakum setelah dicampur dalam rasio 1:1. Glutaraldehida (25%) dibeli dari Acros Organics (Geel, Belgia). Pasta karbon konduktif Custom Ink/CMC 12072021 dibeli dari Cambridge Graphene Ltd. (Gloucestershire, Inggris). Membran sutra-fibroin (kualitas tingkat medis) dan larutan sutra-fibroin (kualitas tingkat medis) disediakan oleh Fibrothelium GmbH (Aachen, Jerman), untuk rincian lihat ref.[ 13 ]

2.2 Pembuatan Elektroda Kerja Berbasis Karbon yang Dapat Diserap Secara Biologis pada Serat Sutra-Fibroin Menggunakan Teknologi Lapisan Tebal
Elektroda kerja karbon sablon dibuat seperti yang dijelaskan pada penelitian sebelumnya. [ 45 ] Secara singkat, elektroda kerja karbon, dimodifikasi dengan 2 wt.% karbon nanotube berdinding banyak, disablon pada substrat sutra-fibroin menggunakan mesin sablon semi otomatis dari Hary Manufacturing Inc (Lebanon, AS) dengan pelat stensil setebal 40 µm. Elektroda sablon diawetkan pada 160 °C selama 1 jam dan kemudian dipasang pada papan sirkuit cetak menggunakan Ecoflex sebagai perekat. Ecoflex adalah polimer sintetis yang biokompatibel dan dapat diserap secara biologis dengan sifat mekanis yang mirip dengan kulit manusia setelah diawetkan. Kontak listrik ke papan sirkuit cetak dibuat menggunakan pasta konduktif perak dan aluminium foil. Setelah pengeringan, bagian atas elektroda karbon pada sutra-fibroin ditutupi dengan lapisan Ecoflex yang telah dicor sebelumnya (memanfaatkan Ecoflex sebagai perekat lagi) dengan lubang 5 mm untuk imobilisasi enzim (dibuat dengan besi pelubang bundar).

2.3 Imobilisasi Glukosa Oksidase pada Elektroda Kerja Karbon Sablon pada Serat Sutra-Fibroin
Dalam penelitian ini, dua strategi imobilisasi enzim yang berbeda dipelajari dan dibandingkan: i) metode standar laboratorium menggunakan matriks berbasis BSA/glutaraldehid; dan ii) matriks imobilisasi berbasis sutra-fibroin. Metode standar laboratorium menggunakan BSA sebagai matriks polimer dan glutaraldehida sebagai pengikat silang. [ 13 , 44 , 45 ] Campuran 1–2–2 GOx, BSA, dan larutan glutaraldehida/gliserol langsung diteteskan ke elektroda karbon yang telah dibuat. Larutan glutaraldehida/gliserol dibuat dengan mencampur 2,0 mL gliserol dan 2,5 mL glutaraldehida dengan 20,5 mL air deionisasi dalam botol kaca. Sebaliknya, untuk matriks imobilisasi berbasis sutra-fibroin, GOx langsung dicampur dengan larutan sutra-fibroin. Dalam percobaan (lihat juga Gambar 2 di bagian 3.1 ), berbagai metode untuk membentuk matriks imobilisasi enzim yang tidak larut dalam air dipelajari. Oleh karena itu, larutan GOx/fibroin sutra juga dicampur dengan etanol (30, 50, dan 70 vol%) atau gliserol (2, 3, 5, dan 10 vol%) dan air suling dalam rasio 2-1-1 sehingga campuran imobilisasi serat sutra yang dihasilkan mengandung kandungan serat sutra 1 wt.% yang disebutkan.

Tetesan 20 µL larutan imobilisasi tertentu diaplikasikan ke elektroda kerja karbon, menghasilkan imobilisasi 16 U GOx menggunakan matriks BSA, atau 0,6 U dan 1,2 U GOx menggunakan matriks sutra-fibroin (Catatan: percobaan awal menunjukkan bahwa kandungan enzim >1,2 U GOx untuk matriks imobilisasi berbasis sutra-fibroin tidak akan lebih jauh meningkatkan kinerja biosensor).

Setelah dikeringkan pada suhu ruangan, elektroda dibilas dengan larutan penyangga fosfat (PBS, pH 7,4) untuk menghilangkan GOx yang tidak terikat sebelum menyiapkan pengukuran. Dalam kasus matriks imobilisasi sutra-fibroin murni (tanpa etanol atau gliserol), matriks kering direndam dalam larutan etanol 80 vol% selama 30 detik untuk membentuk lapisan sutra-fibroin yang tidak larut dalam air sebelum dibilas dengan PBS. Skema dari dua strategi imobilisasi yang berbeda dan contoh gambar mikroskopis elektroda kerja karbon dengan membran GOx yang diimobilisasi ditunjukkan pada Gambar 1 .

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Atas: Sketsa dari dua metode imobilisasi yang berbeda untuk mengikat glukosa oksidase pada elektroda kerja karbon hasil sablon yang dimodifikasi dengan 2 wt.% multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs); matriks BSA/glutaraldehid (kiri) dan matriks sutra-fibroin (kanan). Bawah: Gambar mikroskopis permukaan elektroda karbon yang dimodifikasi dengan glukosa oksidase menggunakan matriks BSA/glutaraldehid (kiri) dan matriks sutra-fibroin (kanan). Elektroda kerja karbon dienkapsulasi oleh Ecoflex. Batang skala putih pada gambar mikroskopis sama dengan 500 µm.
2.4 Karakterisasi Sensor Elektrokimia
Karakterisasi elektrokimia biosensor glukosa dilakukan dalam pengaturan tiga elektroda yang terdiri dari elektroda referensi Ag/AgCl konvensional (Deutsche Metrohm GmbH & Co. KG, Filderstadt, Jerman), kawat platinum sebagai elektroda lawan (MaTeck GmbH, Jülich, Jerman) dan elektroda kerja karbon sablon fungsional pada substrat sutra-fibroin. Elektroda dihubungkan ke potensiostat (PalmSens3, Palm Instruments BV, GA Houten, Belanda) dan dioperasikan oleh perangkat lunak PSTrace (versi 5.9). Untuk memastikan keterbandingan biosensor, semua data diproses terlebih dahulu dengan koreksi garis dasar linier dalam perangkat lunak PSTrace, menggunakan 10 menit pertama setiap pengukuran sebagai referensi. Semua pengukuran dilakukan dalam PBS, pH 7,4, pada suhu 21 °C dengan potensial kerja terapan 0,8 V versus elektroda referensi Ag/AgCl melalui kronoamperometri, kecuali dinyatakan lain. Konsentrasi glukosa dalam kisaran 0,5 hingga 10 mm ditetapkan dengan menggunakan larutan stok 250 mm . Setiap konsentrasi diukur selama 10 menit.

Untuk percobaan mengenai pengaruh pH (lihat bagian 3.2 ), PBS dengan nilai pH 5,5 pada suhu 21 °C disiapkan, ditambahkan 4 m m glukosa, kemudian nilai pH ditingkatkan bertahap (dalam 0,5 langkah) dengan menambahkan larutan natrium hidroksida pekat (1 mol/L) dan diperiksa dengan pH meter eksternal.

Untuk percobaan mengenai pengaruh suhu (lihat bagian 3.2 ), 4 m m glukosa ditambahkan ke PBS, pH 7,4, pada suhu 21 °C. Setelah mencapai kondisi steady-state, suhu dinaikkan (30, 40, 50, 60 dan 70 °C) dan ditahan selama 30 menit. Setelah setiap kenaikan suhu, PBS didinginkan hingga 21 °C dan ditahan selama 15 menit.

2.5 Analisis Statistik
Koreksi garis dasar linear dilakukan dalam perangkat lunak PSTrace untuk semua pengukuran amperometrik terkait sensitivitas, menggunakan 10 menit pertama setiap pengukuran sebagai referensi. Kecuali dinyatakan lain dalam gambar, semua data yang disajikan dalam pekerjaan ini adalah nilai rata-rata ± simpangan baku. Perhitungan dilakukan menggunakan perangkat lunak OriginPro 2020b.

3 Hasil dan Pembahasan
3.1 Optimalisasi Matriks Imobilisasi Berbasis Sutra-Fibroin untuk Deteksi Glukosa Amperometrik
Dalam percobaan pertama, kami mempelajari berbagai perlakuan untuk menyiapkan matriks imobilisasi enzim berbasis fibroin-sutra yang tidak larut dalam air (mengandung 1 wt.% fibroin-sutra). Oleh karena itu, matriks imobilisasi fibroin-sutra kering a) direndam dalam etanol 80 vol% selama 30 detik, atau b) larutan fibroin-sutra cair dimodifikasi dengan larutan etanol berkonsentrasi berbeda (30, 50, dan 70 vol%) atau gliserol (2, 3, 5, dan 10 vol%), masing-masing. Karakterisasi dilakukan dengan serangkaian pengukuran glukosa amperometrik, yang menentukan pengaruh perlakuan terpilih terhadap kinerja biosensor yang dihasilkan. Pengukuran dilakukan dalam PBS, pH 7,4, pada 21,0 °C dengan konsentrasi glukosa antara 0,5 dan 10 mm3 . Sensitivitas glukosa rata-rata, ditentukan oleh kesesuaian linier dalam rentang konsentrasi antara 0 hingga 4 mm glukosa untuk perawatan yang berbeda, ditampilkan dalam Gambar 2 .

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Sensitivitas glukosa rata-rata elektroda kerja karbon dengan glukosa oksidase yang diimobilisasi menggunakan larutan fibroin sutra 1 wt.% tanpa dan dengan larutan etanol atau gliserol dengan konsentrasi berbeda dalam rasio 2 ekuivalen larutan fibroin sutra, 1 ekuivalen larutan etanol atau 1 ekuivalen larutan gliserol, dan 1 ekuivalen air suling. Jumlah fibroin sutra dijaga konstan untuk semua percobaan. Data disajikan sebagai nilai rata-rata ± simpangan baku, n = 3 sensor.
Elektroda kerja dari kelompok sampel pertama “1 wt.% Silk-fibroin” dimodifikasi dengan 20 µL larutan silk-fibroin 1 wt.% yang mengandung 0,6 U GOx. Setelah pengeringan, kelompok ini direndam dalam 80 vol% etanol selama 30 detik untuk membentuk matriks imobilisasi yang tidak larut dalam air. Pada kelompok sampel kedua dan ketiga, 1 eq. “X vol% Etanol” atau 1 eq. “Y vol% Gliserol” dan 1 eq. air suling ditambahkan ke 2 eq. larutan silk-fibroin yang mengandung enzim untuk membentuk matriks imobilisasi yang tidak larut dalam air. Perhatian yang ketat diberikan untuk memastikan bahwa kandungan silk-fibroin dan GOx dalam semua matriks sesuai dengan kelompok sampel pertama “1 wt.% Silk-fibroin” untuk perbandingan langsung.

Semua varian perlakuan yang dipilih memungkinkan pembentukan matriks imobilisasi berbasis fibroin-sutra yang tidak larut dalam air yang melekat dengan baik pada permukaan elektroda kerja karbon. Sebaliknya, perbedaan ditemukan dalam analisis elektrokimia. Di sini, tren yang jelas dapat diidentifikasi antara kelompok sampel etanol dan kelompok sampel gliserol. Kelompok sensor yang diberi perlakuan etanol selalu menunjukkan sensitivitas glukosa rata-rata yang lebih rendah hingga 10,6 ± 5,7 nA·mm −2 ·m m −1 dibandingkan dengan kelompok sampel “1 wt.% fibroin-sutra” dengan sensitivitas glukosa rata-rata 23,6 ± 6,6 nA·mm −2 ·m m −1 .

Misalnya, Dudkaitė et al. menunjukkan bahwa paparan GOx terhadap etanol selama 24 jam secara drastis mengurangi efisiensi katalitik hingga 76%. [ 53 ] Mekanisme yang sama mungkin diharapkan di sini karena GOx terpapar etanol untuk jangka waktu yang lama selama proses pengeringan (lebih dari 6 jam). Paparan jangka panjang terhadap etanol mendorong pembentukan jembatan garam pada permukaan GOx, menghasilkan agregat enzim beberapa ratus nanometer. [ 53 ] Fenomena ini menyebabkan berkurangnya efisiensi katalitik GOx, sehingga mengurangi sensitivitas glukosa rata-rata dari biosensor glukosa yang dikembangkan. Sebaliknya, penambahan gliserol akan meningkatkan aktivitas GOx dengan mengendalikan lingkungan mikro enzimatik. [ 54 ] Perilaku ini juga dapat dilihat dalam data kami karena sensitivitas glukosa rata-rata dari sampel sensor yang diolah dengan gliserol (3, 5, dan 10 vol%) meningkat hingga maksimum 34,1 ± 16,0 nA·mm −2 ·m m −1 (5 vol% gliserol) dan mulai menurun setelahnya. Pada saat yang sama, simpangan baku meningkat tajam untuk sampel yang diolah dengan gliserol 5 vol% dan 10 vol% dibandingkan dengan sampel “1 wt.% Silk-fibroin”.

Singkatnya, ketiga metode tersebut menghasilkan matriks imobilisasi yang tidak larut dalam air. Penambahan etanol berdampak negatif pada kinerja biosensor dengan melemahkan sensitivitas glukosa rata-rata, sementara penambahan gliserol meningkatkan sensitivitas rata-rata tetapi juga menghasilkan deviasi standar yang lebih tinggi dari sinyal sensor. Perendaman singkat (30 detik) matriks imobilisasi serat sutra kering dalam etanol 80 vol% tampaknya tidak memiliki efek negatif yang sama, seperti penambahan etanol, pada kinerja biosensor dan oleh karena itu digunakan untuk eksperimen lebih lanjut.

Berikutnya, pengaruh kandungan sutra-fibroin dan pemuatan GOx dipelajari. Untuk tujuan ini, jumlah sutra-fibroin dalam matriks imobilisasi enzim divariasikan antara 0 dan 8 wt.%. Pada 0 wt.% sutra-fibroin, jumlah GOx yang sesuai dilarutkan dalam PBS yang dilapisi tetes ke permukaan elektroda karbon, dan diperlakukan serupa dengan biosensor lainnya, termasuk perendaman etanol. Pemuatan enzim dipilih berdasarkan percobaan awal, yang menunjukkan bahwa kinerja biosensor mencapai batas atas pada GOx yang diimobilisasi 1,2 U sehubungan dengan sensitivitas glukosa rata-rata yang dicapai. Gambar 3 a ) menampilkan sensitivitas glukosa rata-rata dalam rentang konsentrasi linier dari 0 hingga 4 mm glukosa untuk biosensor yang dimodifikasi dengan 0 hingga 8 wt.% sutra-fibroin, dan 0,6 atau 1,2 U GOx. Gambar 3b ) menggambarkan dua respons dinamis yang patut dicontoh dari biosensor glukosa dengan 0,6 dan 1,2 U GOx, masing-masing, yang diimobilisasi dalam matriks serat-sutra 0,5 wt.%. Biosensor ini menunjukkan respons yang jelas dan dapat dibedakan terhadap konsentrasi glukosa hingga 10 mm .

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
a) Sensitivitas glukosa rata-rata elektroda kerja karbon, disablon pada substrat sutra-fibroin yang dimodifikasi dengan GOx 0,6 U (biru) atau 1,2 U (hijau), menggunakan sutra-fibroin sebagai matriks imobilisasi dalam berbagai konsentrasi (dari 0 hingga 8 wt.%). Ketidaklarutan dalam air dicapai dengan merendam matriks kering dalam etanol 80 vol% selama 30 detik. Sampel “0 wt.% Sutra-fibroin” sesuai dengan GOx yang dilarutkan dalam larutan penyangga fosfat (PBS) dan diteteskan ke permukaan elektroda karbon. Data disajikan sebagai nilai rata-rata ± simpangan baku, n = 3 sensor. b) Dua respons dinamis karakteristik biosensor glukosa dengan GOx 0,6 U (biru) dan 1,2 U (hijau), masing-masing, diimobilisasi dalam matriks sutra-fibroin 0,5 wt.%.
Untuk kedua konsentrasi enzim, matriks sutra-fibroin meningkatkan kinerja biosensor glukosa dibandingkan dengan GOx yang terikat secara adsorptif (0 wt.% sutra-fibroin). Secara khusus, pada kandungan enzim rendah 0,6 U/biosensor, matriks sutra-fibroin (0,5 wt.% sutra-fibroin) memungkinkan memiliki sensitivitas glukosa rata-rata ≈4 kali lebih tinggi. Sensitivitas glukosa rata-rata maksimum 42,1 ± 2,2 nA·mm −2 ·m m −1 untuk 0,6 U dan 32,5 ± 8,3 nA·mm −2 ·m m −1 untuk 1,2 U dicapai dengan matriks imobilisasi 0,5 wt.% sutra-fibroin. Selain itu, penggunaan fibroin sutra sebagai matriks imobilisasi untuk GOx menghasilkan peningkatan hampir dua kali lipat dalam sensitivitas glukosa rata-rata yang dicapai, dibandingkan dengan temuan publikasi kami sebelumnya, di mana 25 nA·mm −2 ·m m −1 dapat dicapai dengan menggunakan matriks imobilisasi berbasis BSA/glutaraldehid. [ 45 ] Pada saat yang sama, pemuatan enzim dapat dikurangi secara menguntungkan dari 16 menjadi 0,6 U GOx. [ 13 , 44 , 45 ]

Singkatnya, kandungan fibroin sutra rendah sebesar 0,5 wt.% bersama dengan muatan GOx rendah sebesar 0,6 U mencapai kinerja biosensor glukosa yang paling banyak dipelajari dan oleh karena itu digunakan untuk percobaan pada bab berikutnya.

Variasi kandungan sutra-fibroin menghasilkan sensitivitas glukosa rata-rata maksimum pada 0,5 wt.% sutra-fibroin untuk kedua konsentrasi enzim (0,6 dan 1,2 U). Ang et al. menunjukkan dalam percobaan mereka bahwa matriks imobilisasi berbasis kitosan yang lebih tipis menyebabkan berkurangnya penghalang difusi untuk H 2 O 2 , dan oleh karena itu, kinerja biosensor mereka (GOx yang diimobilisasi oleh kitosan pada elektroda platinum) meningkat dengan berkurangnya ketebalan lapisan matriks imobilisasi. [ 55 ] Matriks yang tebal menghambat transportasi massa substrat karena penghalang difusi yang meningkat. [ 55 ] Fenomena yang sebanding tampaknya terjadi di sini, karena pengurangan kandungan sutra-fibroin mengakibatkan berkurangnya ketebalan lapisan matriks imobilisasi berbasis sutra-fibroin. Ketebalan lapisan matriks sutra-fibroin, yang mengandung 0,6 U GOx, ditentukan oleh pengukur sekrup mikrometer dan diringkas (nilai rata-rata ± simpangan baku) dalam Tabel 1 .

Tabel 1. Ketebalan lapisan rata-rata matriks imobilisasi yang mengandung glukosa oksidase (GOx: 0,6 U) yang terdiri dari bovine serum albumin (BSA) dan glutaraldehida, atau sejumlah fibroin sutra yang berbeda (dari 0,5 hingga 8 wt.%).

3.2 Matriks Imobilisasi Berbasis Sutra-Fibroin: Pengaruh pH dan Suhu
Menurut penelitian oleh Demura dan Asakura, dan Lu et al., imobilisasi GOx ke dalam matriks sutra-fibroin akan menghasilkan i) pergeseran nilai pH optimal enzim, ii) peningkatan resistensi terhadap variasi suhu dan iii) peningkatan daya simpan. [ 51 , 56 ] Efek pH dan suhu pada sinyal biosensor yang dihasilkan dipelajari untuk biosensor glukosa dengan matriks imobilisasi berbasis sutra-fibroin dan biosensor glukosa dengan matriks imobilisasi BSA/glutaraldehid “konvensional”.

Untuk pH optimum GOx yang dilaporkan, ia bergeser dari pH 5,5 ke pH 7,5 dengan adanya fibroin sutra. [ 51 ] Demura dan Asakura menentukan aktivitas GOx bebas pada nilai pH yang berbeda (pH 5 hingga pH 8) dan membandingkannya dengan aktivitas yang ditentukan ketika GOx tertanam dalam matriks fibroin sutra. Namun, percobaan mereka tidak dilakukan untuk menyelidiki efek tersebut pada biosensing glukosa amperometrik. Oleh karena itu, percobaan berikut dilakukan dalam studi ini: dua jenis biosensor yang berbeda (matriks fibroin sutra, matriks BSA/glutaraldehid) dikarakterisasi dalam larutan PBS yang mengandung glukosa 0 atau 4 mm . Nilai pH larutan PBS ditingkatkan secara bertahap (dengan pH 0,5) dari pH 5,5 ke pH 8,0 dengan menambahkan larutan natrium hidroksida. Gambar 4 menggambarkan perbedaan arus rata-rata elektroda kerja berbasis karbon tertentu (arus yang diukur pada glukosa 4 mm dikurangi arus yang diukur pada glukosa 0 mm ) untuk kedua metode imobilisasi.

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Selisih arus rata-rata (sinyal tanpa kehadiran glukosa dikurangi dari sinyal yang terekam dengan adanya glukosa 4 mm ) dari elektroda karbon hasil sablon pada substrat fibroin sutra fleksibel yang dimodifikasi dengan glukosa oksidase menggunakan matriks imobilisasi berdasarkan bovine serum albumin (BSA)/glutaraldehid (kotak biru) atau fibroin sutra (segitiga hijau). Data disajikan sebagai nilai rata-rata ± simpangan baku, n = 6 sensor.
Pembacaan dasar (tidak ada glukosa yang terdapat dalam analit) dari kedua kelompok sensor meningkat sedikit dengan meningkatnya nilai pH (data tidak ditampilkan). Fenomena ini mungkin dapat dikaitkan dengan perubahan konduktivitas larutan dan reaksi samping pada permukaan elektroda karbon, atau dalam matriks imobilisasi, yang disebabkan oleh penambahan natrium hidroksida. [ 57 ] Pada saat yang sama, pengukuran dengan adanya glukosa 4 mm menunjukkan perubahan sinyal yang jauh lebih tinggi, yang mengarah pada peningkatan terus-menerus dalam perbedaan arus rata-rata yang diukur dengan meningkatnya nilai pH. Sinyal biosensor dengan matriks berbasis sutra-fibroin menunjukkan peningkatan hingga nilai maksimum 56,8 nA·mm −2 pada pH 8, tren yang diamati secara serupa untuk biosensor dengan matriks berbasis BSA/glutaraldehid (27,9 nA·mm −2 ). Berbeda dengan penyelidikan Demura dan Asakura, percobaan ini tidak menunjukkan pH optimum pada 7,5, karena tidak ada nilai maksimum yang ditemukan dalam rentang pH yang dipelajari. Namun, pergeseran pH optimum yang sama dapat diamati, mungkin disebabkan oleh adanya muatan negatif tetap pada membran sutra-fibroin. [ 51 ]

Singkatnya, serat sutra-fibroin sebagai matriks imobilisasi untuk GOx menyediakan lingkungan yang lebih disukai bagi enzim sehingga menghasilkan aktivitas yang lebih tinggi pada nilai pH yang lebih basa. Sistem berbasis BSA/glutaraldehid pada elektroda karbon juga menggeser nilai pH optimal ke rezim yang lebih basa, namun, dengan cara yang tidak terlalu kentara.

Untuk pengujian, kinerja biosensor pada berbagai suhu, dua jenis biosensor yang berbeda (matriks sutra-fibroin, matriks BSA/glutaraldehid) kembali diekspos ke glukosa 0 dan 4 mm , masing-masing, dan suhu divariasikan secara bertahap antara 21 dan 70 °C (menggunakan sistem Lauda Omnicool berbasis elemen Peltier dengan kemudi aktif). Suhu yang diteliti adalah 21, 30, 40, 50, 60 dan 70 °C, setiap suhu ditetapkan selama 30 menit. Setelah setiap siklus suhu, suhu diturunkan menjadi 21 °C dan dipertahankan konstan selama 15 menit untuk mengamati efek perlakuan panas. Untuk evaluasi, arus yang diukur pada langkah suhu 21 °C pertama dikurangi dari semua pengukuran (dasar). Hasil dari dua biosensor glukosa contoh dengan kehadiran (4 mm ) dan ketidakhadiran (0 mm ) glukosa dengan matriks sutra-fibroin (kiri, warna hijau) atau matriks BSA/glutaraldehid (kanan, warna biru) ditunjukkan pada Gambar 5 .

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Respons dinamis yang patut dicontoh dari elektroda karbon sablon pada fibroin sutra yang dimodifikasi dengan glukosa oksidase yang diimobilisasi dalam a) matriks fibroin sutra (warna hijau), atau b) matriks berdasarkan albumin serum sapi dan glutaraldehida (warna biru), dengan adanya (4 mm ) dan tanpa adanya (0 mm ) glukosa untuk berbagai suhu antara 21 °C (panah merah) dan 70 °C.
Menurut literatur, aktivitas glukosa oksidase bergantung pada suhu, dengan nilai suhu optimal untuk GOx (tanpa imobilisasi) menjadi ≈40 °C; suhu yang lebih tinggi menyebabkan denaturasi dan hilangnya aktivitas. [ 57 ] Seperti yang dapat dilihat pada Gambar 5 , sinyal biosensor untuk kedua metode imobilisasi meningkat secara stabil dengan adanya glukosa 4 mm hingga 70 °C, di mana ia mencapai nilai rata-rata 623,2 ± 58,4 nA·mm −2 (Gambar 5a ), hijau muda) dan 432,4 ± 50,6 nA·mm −2 (Gambar 5b ), biru tua). Seperti yang dapat dilihat dari percobaan, untuk biosensor dengan matriks sutra-fibroin, perbedaan arus antara 4 dan 0 mm juga memiliki maksimum pada ≈40 hingga 50 °C, yang sesuai dengan data dari literatur. [ 57 ] Untuk suhu yang lebih tinggi (60 dan 70 °C), noise pada sinyal sensor juga lebih jelas. Peningkatan sinyal juga dapat diamati tanpa adanya glukosa (0 mm ) . Di sini, arus mencapai nilai rata-rata 556,3 ± 26,1 nA·mm −2 (fibroin sutra, hijau tua) dan 152,0 ± 11,0 nA·mm −2 (BSA, biru muda). Perilaku ini mungkin dapat dikaitkan dengan peningkatan mobilitas ion dalam larutan dan reaksi samping biopolimer (perubahan derajat kristalinitas) dalam matriks imobilisasi. Selain itu, GOx dapat terdenaturasi pada suhu yang sangat tinggi dan enzim dapat mengalami difusi yang dipercepat (keluar dari membran atau pada permukaan elektroda karbon) karena penurunan penghalang energi. [ 58 , 59 ]

Pergeseran garis dasar ini lebih sedikit terjadi pada biosensor dengan matriks imobilisasi berbasis BSA/glutaraldehid, yang mungkin dapat dikaitkan dengan efek stabilisasi glutaraldehida. Misalnya, López-Gallego dkk. melaporkan bahwa ikatan silang GOx dengan glutaraldehida secara drastis meningkatkan stabilitas enzim terhadap denaturasi termal: aktivitas GOx yang distabilkan oleh glutaraldehida lebih dari 60% setelah 140 jam perlakuan panas berkelanjutan pada suhu 65 °C, sedangkan sampel referensi mereka kehilangan aktivitasnya dalam waktu 10 jam. [ 60 ]

Secara keseluruhan, percobaan menunjukkan bahwa sutra-fibroin merupakan kandidat yang tepat sebagai matriks imobilisasi yang biokompatibel dan dapat diserap secara biologis, memberikan hasil yang sebanding dengan matriks imobilisasi standar laboratorium berdasarkan BSA/glutaraldehid. Dalam kedua kasus, biosensor glukosa menunjukkan respons sinyal amperometrik yang jelas dan dapat dibedakan terhadap konsentrasi glukosa yang diuji antara 0,5 dan 10 mm . Dalam beberapa percobaan yang dilakukan, matriks imobilisasi sutra-fibroin bahkan mencapai daya rekat yang lebih baik pada permukaan elektroda karbon, jika dibandingkan dengan matriks BSA/glutaraldehid. Paparan berulang terhadap larutan PBS dan pengeringan berikutnya tidak dapat merusak matriks sutra-fibroin yang tetap melekat erat pada permukaan elektroda karbon, berbeda dengan sistem berbasis BSA/glutaraldehid, yang sering (sebagian) terlepas. Untuk kedua jenis sensor, pH optimum GOx bergeser ke arah rezim yang lebih tinggi dan lebih basa; tidak ada sinyal maksimum yang ditemukan dalam rentang pH 5,5 hingga pH 8,0 yang dianalisis. Kedua jenis sensor tersebut juga dapat menahan perubahan suhu hingga setidaknya 60 °C selama 30 menit. Di sini, diperlukan eksperimen yang lebih rinci untuk lebih memahami khususnya perilaku suhu dari biosensor yang diteliti dengan pembawa serat sutra bersama dengan matriks enzim serat sutra.

4 Kesimpulan
Untuk elektroda karbon sablon pada substrat serat sutra yang biokompatibel dan dapat diserap secara biologis, matriks imobilisasi berbasis serat sutra untuk enzim glukosa oksidase dikembangkan dan dioptimalkan. Oleh karena itu, pengaruh parameter terkait matriks, seperti kandungan serat sutra, metode untuk membentuk matriks serat sutra yang tidak larut dalam air (yaitu, penambahan etanol atau gliserol, perendaman etanol), dan pemuatan enzim pada sifat elektrokimia biosensor glukosa ditentukan oleh pengukuran kronoamperometrik untuk konsentrasi glukosa yang relevan secara fisiologis antara 0,5 dan 10 mm dalam larutan penyangga fosfat, pH 7,4. Elektroda karbon sablon yang dimodifikasi dengan 0,6 U GOx yang diimobilisasi dalam matriks 0,5 wt.% serat sutra-fibroin dan diolah dengan etanol selama 30 detik menghasilkan sensitivitas tertinggi 42,1 ± 2,2 nA·mm −2 · m −1 (pada 0,8 V vs elektroda referensi Ag/AgCl). Pengaruh pH dan suhu juga dipelajari. Biosensor glukosa dengan matriks imobilisasi berbasis serat sutra-fibroin yang membawa GOx memberikan hasil yang sebanding dengan biosensor glukosa referensi dengan matriks imobilisasi BSA/glutaraldehid, sementara secara bersamaan mengurangi pemuatan enzim hingga 96%. Secara menguntungkan, matriks serat sutra menghindari penggunaan komponen toksik (seperti glutaraldehida), karena sepenuhnya biokompatibel dan dapat diserap secara biologis.

Hasil yang disajikan dalam artikel ini mungkin membuka jalan menuju biosensor yang sepenuhnya biokompatibel dan biodegradabel, yang dapat ditanamkan untuk pengukuran jangka panjang pada pasien. Saat ini, substrat sensor, elektroda kerja, matriks imobilisasi enzim, dan enkapsulasi sepenuhnya biokompatibel dan bioresorbabel. Pekerjaan di masa mendatang akan membahas pemahaman tentang bagaimana sutra-fibroin memengaruhi enzim yang diimobilisasi. Sifat-sifat membran sutra-fibroin sangat dipengaruhi oleh kristalinitas (rasio β-sheet) dari biopolimer. [ 61 ] Oleh karena itu, penting untuk menyelidiki sejauh mana rasio β-sheet dapat memengaruhi enzim yang diimobilisasi. [ 50 ] Dalam penelitian ini, glukosa oksidase dipilih sebagai enzim model. Di sini, percobaan menunjukkan bahwa matriks imobilisasi sutra-fibroin dipengaruhi secara signifikan oleh berbagai parameter GOx yang diimobilisasi, termasuk mengubah nilai pH optimum, meningkatkan stabilitas suhu enzim, dan mengurangi jumlah enzim yang diimobilisasi yang diperlukan. Perpanjangan fungsi sensor untuk enzim lain yang relevan secara medis, seperti urease, lakase, atau penisilinase, dapat menunjukkan kesesuaian mendasar dari strategi imobilisasi yang dikembangkan. Lebih jauh, satu fokus harus ditetapkan pada integrasi gabungan dari elektroda tandingan dan referensi yang sepenuhnya biokompatibel (dan idealnya dapat diserap secara hayati), masing-masing. Pendekatan penelitian di bidang biosensor menunjukkan contoh: Li et al. menunjukkan bahwa karbon aktif adalah bahan yang cocok sebagai elektroda tandingan dalam konfigurasi dua elektroda untuk deteksi amperometrik hidrogen peroksida, [ 62 ] Nath et al. menggunakan karbon berpori aktif yang dapat terurai secara hayati sebagai elektroda tandingan dalam sel surya yang peka terhadap zat warna. [ 63 ] Elektroda referensi yang hijau dan fleksibel (menggunakan sejumlah kecil Ag/AgCl dan pengikat polimer yang biokompatibel) tanpa sitotoksisitas terhadap sel mamalia disarankan oleh Cumba et al. [ 64 ] polimer konduktif biokompatibel PEDOT:PSS (poli(3,4-etilendioksitiofena) polistirena sulfonat) digunakan oleh Tintelott et al. untuk membangun elektroda referensi semu yang stabil untuk transistor efek medan peka ion terintegrasi. [ 65 ] Keunggulan fibroin sutra, terutama dalam aplikasi biomedis, semakin membuka prospek transfer strategi imobilisasi baru ke sensor elektrokimia (bio-)miniatur yang dapat diminiaturisasi seperti perangkat efek medan [ 66 , 67 ] atau sensor potensiometri yang dapat dialamatkan cahaya. [ 68 ]Sebuah probe berbasis LAPS yang akan ditanamkan ke dalam otak adalah salah satu contoh perangkat miniaturisasi yang memerlukan biokompatibilitas tinggi. [ 69 ]